苦参碱抗肝癌细胞增殖的1H-NMR代谢组学研究

肝癌是常见的恶性肿瘤之一，其死亡率在恶性肿瘤中列第3位。目前肝癌的治疗手段主要有外科手术切除、肝动脉/门静脉化疗栓塞术和放射治疗等，但患者5年内生存率低于30%。在肝癌晚期，只有肝动脉化疗栓塞术（TACE）和药物索拉非尼（sorafenib）能够提高生存率，但较多患者难以忍受治疗对机体的副作用^[1-6]。

近年来，不断有研究表明中药在治疗肝癌方面有巨大潜力^[1]。大量临床和实验研究表明，复方苦参注射液具有良好的抑制肿瘤作用，配合放化疗药应用可提高抗肿瘤疗效^[7-8]。苦参碱是复方苦参注射液的主要有效成分之一^[9]，研究表明，苦参碱具有明显的抗肝癌作用，其作用机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关^[10]。然而，由于苦参碱抗肝癌作用机制复杂，目前尚未完全阐明。

代谢组学是一种用于综合分析生物基质中内源性代谢物变化的系统性方法，而细胞代谢组学研究细胞受到外界扰动后细胞内所有代谢物的综合表现^[11]。应用代谢组学方法研究药物作用于细胞后内源性代谢物的变化，寻求潜在的生物标记物，进而阐释药物作用机制，已逐渐成为药物作用机制研究的常见手段^[12-13]。本实验应用¹H-NMR代谢组学技术结合多元统计方法分析苦参碱对人肝癌SMMC-7721细胞中内源性代谢产物的变化规律，发现苦参碱抗肝癌的潜在生物标志物，为阐释苦参碱抗肝癌的作用机制奠定基础。

1  材料

1.1  细胞

SMMC-7721细胞由天津肿瘤医院吴雄志教授课题组惠赠。

1.2  药品与试剂

苦参碱（批号JZ20160618，质量分数＞98%），购自南京景竹生物科技有限公司；5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）购自北京索莱宝科技有限公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰酶、青链霉素及二甲基亚砜（DMSO）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；CCK8试剂盒购自日本东仁化学科技公司；核磁试剂重水、2,3,3-三甲基甲硅烷基丙酸（TSP）购自美国Norell公司；娃哈哈纯净水。

1.3  仪器

Bruker 600 MHz Avance III NMR Spectrometer（600.13MHz，德国Bruker公司）；SartoriusBSA124S分析天平（德国Sartorius公司）；TGL-16高速台式冷冻离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；细胞培养箱（力康生物医疗科技控股有限公司）；低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；Infinite M200 Pro多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）；SCIENTZ-12N真空冷冻干燥机和UP-250超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

2  方法

2.1  细胞培养

SMMC-7721细胞在37 ℃、5% CO₂饱和湿度下，于含10%胎牛血清、100 g/L青霉素及100 g/L链霉素的DMEM培养液中培养，细胞生长至对数期进行实验。

2.2  细胞形态学检测

将SMMC-7721细胞以5×10⁴个/孔接种于6孔板，每孔接种2 mL。培养24h后，分别加入含0.5、1.0、2.0 mg/mL苦参碱的培养基，孵育24 h后，倒置显微镜下观察细胞形态并拍照，比较细胞形态变化。

2.3  CCK8法测定细胞增殖

将SMMC-7721细胞以5×10⁴个/孔接种于96孔板，每孔接种100 μL。培养24 h后，分别加入含苦参碱0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL的培养液，阳性对照组加入含10 μg/mL 5-FU的培养液，对照组只加培养液，每组设6个复孔。继续培养24 h后，每孔换入含有CCK8的培养基，37 ℃孵育2 h，用酶标仪在490 nm处测定其吸光度（A）值，计算细胞存活率。

细胞存活率═A_药物/A_对照

2.4  细胞收集及¹H-NMR测定样品的制备

将SMMC-7721细胞接种于50 cm²的培养皿中培养，当细胞生长至80%时，加入含苦参碱2.0mg/mL的培养基，培养24 h。细胞计数后，分别收集细胞和培养基。用细胞刮刀刮下培养皿中的细胞（3×10⁷～4×10⁷个），4 ℃、1 000 r/min离心5 min，PBS洗涤沉淀2次，收集沉淀于液氮中速冻，−80℃保存；细胞培养上清液置于50mL离心管中，4 ℃、1 000 r/min离心10 min，收集上清液，于液氮中速冻，−80 ℃保存。

参考文献方法^[14-15]，从−80 ℃中取出细胞沉淀和细胞培养上清液于4 ℃中融化。细胞提取方法：通过反复冻融和超声波对细胞进行破碎，即反复冻融细胞5次后，在细胞沉淀中加入4 ℃预冷的甲醇水溶液（甲醇-水1∶2）1 mL，反复吹打均匀，于冰上超声破碎5 min（超5 s，停9 s）。4 ℃、13 000 r/min离心10 min，收集上清，并向沉淀中添加1 mL甲醇水溶液，重复以上超声破碎，收集2次上清于5 mL EP管中冻干。细胞培养上清液提取方法：取2 mL培养液于5 mL EP管中冻干。

向细胞裂解液和细胞培养上清液冻干粉中加入600 μL重水配制的0.1mol/L PBS（pH 7.4），其中分别含有0.005%和0.02% TSP，4 ℃、13 000 r/min离心10min，取上清于5 mm NMR管中测试。

2.5  ¹H-NMR测定与谱图处理

样品于Bruker 600 MHz AVANCE III NMR仪上测定（25 ℃），采用1D CPMG（Carr-Purcell- Meiboom-Gill）脉冲序列，检测谱宽12 345.7 Hz，扫描次数为64，FID分辨率0.188 Hz，脉冲时间14s，采样时间2.654 s，延迟时间1.0 s，采样间隔40.5 s，采样点为65 536。

所有谱图采用MestReNova（Mestrelab Research，Santiago de Compostella，Spain）核磁图谱专业处理软件对¹H-NMR图谱进行傅里叶转换，并进行手动相位、基线调整。谱图中以TSP校准化学位移，以δ 0.01对化学位移区间δ 0.50～9.00进行分段积分，排除δ 4.5～5.0区域的水峰不进行积分，并将积分数据进行归一化。将上述数据保存在Excel文档中，用于多元统计分析。

运用SIMCA-P 13.0（Umetrics公司，瑞士）软件将积分数据进行中心化和规格化后，进行偏最小二乘法判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）和正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal PLS-DA，OPLS-DA），找出样品间的差异代谢产物。

2.6  网络构建

根据MetPA所富集代谢通路中的代谢物，应用Cytoscape软件的Metscape^[16]插件构建苦参碱发挥抗肝癌作用的代谢网络。

2.7  统计学方法

数据以表示，采用统计学软件Prism GraphPad 5.0进行统计分析，通过t检验比较组间差异。

3  结果

3.1  苦参碱对SMMC-7721细胞形态的影响

取对照组细胞及0.5、1.0、2.0 mg/mL苦参碱处理24 h后的细胞，倒置显微镜下观察。结果如图1所示，可见对照组细胞多呈卵圆形、梭形，贴壁生长，而给药组细胞相互分散，细胞数量减少，且随着药物浓度质量增加，凋亡细胞的比例也明显增高，细胞皱缩明显，体积缩小。

3.2  苦参碱对SMMC-7721细胞增殖的影响

CCK8法结果显示，0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL苦参碱作用SMMC-7721细胞24 h后，可剂量依赖性抑制细胞增殖。其中1.0、2.0、4.0 mg/mL苦参碱能显著抑制SMMC-7721细胞增殖，苦参碱对SMMC-7721细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）为（1.68±0.28）mg/mL（图2）。

3.3  图谱指认与分析

参照文献报道^[17-18]并结合公共数据库HMDB（http://www.hmdb.ca/）、BMRB（http://www.bmrb. wisc.edu/）及软件Chenomx NMR Suite（ChenomxInc 公司），对图谱中的主要化合物进行指认，图3为细胞及培养上清液的¹H-NMR图谱，其中在细胞中共指认出37种内源性代谢产物，培养上清液中共指认出22种内源性代谢产物，见表1。

3.4  多元统计分析

为进一步确定各组间代谢物的差异，采用有监督的PLS-DA对所有样本进行¹H-NMR代谢轮廓分析，结果见图4（PLS-DA模型参数分别为A：R²_X＝0.692，R²_Y＝0.997，Q²_Y＝0.96；B：R²_X＝0.532，R²_Y＝0.999，Q²_Y＝0.978）。细胞和培养上清液中，对照组和给药组均沿t[1] 轴明显分开，进一步说明苦参碱作用于SMMC-7721细胞后，对细胞的代谢产生了比较显著的影响。有监督的模式识别方法需用外部模型验证方法排列实验来证明模型的有效性。由图4可知，两条回归线的斜率较大，下方回归线与纵轴截距较小，其中所有的R²和Q²的值均低于原始值，表明模型验证有效。

对结果进行OPLS-DA分析，得到VIP值，选出VIP＞1的代谢产物，并结合独立样本t检验P＜0.05筛选出差异代谢物。由表2可知，给予苦参碱后，细胞内发现15个差异代谢物，培养液中发现6个差异代谢物。

3.5  差异代谢物的相关分析

相关性分析结果如图5所示，可以看出细胞内外代谢产物的相关性。结合表1，可以看出细胞外缬氨酸、琥珀酸、乙醇胺、甘氨酸、丙氨酸与细胞内苯丙氨酸、酪氨酸、肌酐、甘磷酸胆碱、肌醇负相关性较强。细胞内苏氨酸、次黄嘌呤之间正相关性较强；细胞外缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸之间正相关性较强。可见苦参碱抗肝癌的作用机制可能与多条代谢通路相关，且这些代谢物与代谢途径相互关联、相互影响。

3.6  代谢通路分析

将这些差异代谢物输入metaboanalyst中进行通路富集分析，MetPA通路分析结果如图6所示。苦参碱干预后，15条代谢通路发生显著变化，综合Holm P值、FDR（false discovery rate）和Impact值共发现苦参碱干预SMMC-7721细胞的6条代谢通路：牛磺酸和亚牛磺酸代谢，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，苯丙氨酸代谢，肌醇磷酸代谢。

3.7  苦参碱抗肝癌代谢网络构建

根据MetPA富集代谢通路中的代谢物，构建与苦参碱抗肝癌相关的代谢网络。整个代谢网络包括138个节点（主要化合物）和252个边缘（主要反应），在同一数据库中包含193个反应通路（图7）。

4  讨论

已有研究表明，氨基酸代谢紊乱与肿瘤发生发展密切相关^[19-20]。氨基酸分解代谢后，可转化为α-酮酸，进而转变为葡萄糖、酮体等物质，最终参与三羧酸循环。在肝线粒体中，谷氨酸由谷氨酸脱氢酶催化氧化脱氨后再水解生成α-酮戊二酸。肝癌发生过程中，由于细胞增殖、能量需求旺盛、三羧酸循环等供能途径加强，导致肿瘤细胞对谷氨酸有很高摄取率^[21]。因此，在肝癌细胞中谷氨酸的量增加，而苦参碱能显著下调细胞内谷氨酸的量。细胞外琥珀酸的量上升，可能是苦参碱破坏了SMMC-7721细胞能量代谢途径三羧酸循环造成的。免疫系统是体内主要的抗肿瘤防御系统，在体内谷氨酰胺维持着免疫系统的基本功能。另外，谷氨酰胺还保护细胞、组织和器官免受自由基的损害^[22]。给予苦参碱后谷氨酰胺水平的升高提示苦参碱可能增强了细胞的抗氧化活性，改善了细胞膜损伤、免疫功能障碍和自由基损伤。

支链氨基酸即亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸为体内必需氨基酸，与蛋白质的生物合成与降解有关，不仅具有增强免疫防护的作用^[23]，其产生ATP的效率也远高于其他氨基酸^[24]。研究表明，支链氨基酸可能通过参与机体能量代谢过程来加速糖异生，这有利于能量供应^[25]。与对照组相比，给予苦参碱能明显上调细胞中亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的量，提示苦参碱可能通过参与能量代谢来抑制肝癌细胞的增殖。非必需氨基酸在肿瘤细胞代谢过程中发挥重要的作用。甘氨酸作为非必需氨基酸，是合成代谢过程中一碳单位的提供者，也是合成嘌呤及核酸的重要原料^[26]。甘氨酸可经甘氨酸羟甲基转移酶催化反应，生成丝氨酸和四氢叶酸，后者是DNA合成过程中重要的辅酶^[27]。本研究发现苦参碱能显著降低细胞内外甘氨酸的量，进而使四氢叶酸合成减少，抑制DNA合成，最终抑制肝癌细胞增殖。

本研究对苦参碱调节SMMC-7721细胞后的差异代谢物进行相关性分析，发现肌醇和丙氨酸与多数差异代谢物具有显著相关性。肌醇量与体内免疫系统的功能密切相关，提示苦参碱可能通过调节免疫系统来发挥抗肝癌作用。丙氨酸可转运新陈代谢过程中所产生的氨、增加糖异生，并维持血中葡萄糖量保持正常水平^[28-29]。另外，有研究表明^[26]伴随肝癌细胞的增殖，丙氨酸量明显升高，而苦参碱能明显降低丙氨酸的量，提示苦参碱可能通过调节糖代谢和能量代谢发挥作用。

代谢途径是细胞内发生的一系列化学反应，与一定的生物学功能有关。代谢途径分析对于鉴别和量化生化反应网络中的代谢物具有重要意义^[30]。Metscape是人类代谢网络环境下实验代谢组学和基因表达数据交互式探索和可视化的工具，允许用户构建和分析基因或化合物网络，并可视化代谢物数据的变化^[31]。为了进一步了解代谢物之间的关系，将苦参碱调控的6条代谢通路的代谢物映射到京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）数据库：牛磺酸和亚牛磺酸代谢，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，苯丙氨酸代谢，肌醇磷酸代谢，并构建了代表生化反应的节点（代谢物）和边缘的复合网络，可以看出苦参碱抗肝癌的作用具有多环节、多层次综合作用的特点。

本研究从整体代谢水平研究苦参碱抑制SMMC-7721细胞增殖的作用，结果表明苦参碱能够显著调节SMMC-7721细胞中差异代谢物的量，改善细胞的代谢紊乱。

参考文献（略）

来  源：王珂欣，高  丽，周玉枝，秦雪梅，杜冠华. 苦参碱抗肝癌细胞增殖的1H-NMR代谢组学研究 [J]. 中草药, 2017, 48(20):4275-4283.